Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.accesso aperto alla ricerca scientifica e medicaDalla presentazione alla prima decisione editoriale.Dall'accettazione editoriale alla pubblicazione.Riviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso libero.Dove Medical Press è membro dell'OAI.Ristampe in blocco per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione accelerata degli articoli.Registra i tuoi dettagli specifici e farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via e-mail.Torna a Diari » Dermatologia clinica, cosmetica e sperimentale » Volume 15Autori Ke J, Wang J, Wu X, Yan YPubblicato il 2 agosto 2022 Volume 2022:15 Pagine 1499—1508DOI https://doi.org/10.2147/CCID.S367233Revisione tramite revisione tra pari anonima singolaEditore che ha approvato la pubblicazione: Dr Jeffrey WeinbergJin Ke, Jie Wang, Xing Wu, Dipartimento di dermatologia di Yuehua Yan, Ospedale Pudong di Shanghai, Centro medico di Pudong dell'Università Fudan, Shanghai, 201399, Repubblica popolare cinese Corrispondenza: Yuehua Yan, Dipartimento di dermatologia, Ospedale Pudong di Shanghai, Università di Pudong Medical di Fudan Center, No. 2800 Gongwei Road, Pudong New District, Shanghai, 201399, Repubblica popolare cinese, Tel +86-18918181952, Email [email protected] Introduzione: L'autofagia è un processo importante per il mantenimento dell'omeostasi intracellulare ed è deregolamentata nell'ultravioletto B ( Lesione cutanea indotta da UVB).Il salidroside (SAL) è un principio attivo estratto dalla Rhodiola rosea, un medicinale a base di erbe che ha mostrato protezione contro i raggi ultravioletti (UV).Qui, abbiamo studiato le funzioni e i meccanismi di SAL sul danno ossidativo delle cellule della pelle indotto da UVB e sull'autofagia.Metodi: La linea cellulare di cheratinociti immortalati dall'uomo HaCaT è stata utilizzata come modello cellulare di danno da raggi UV.Le cellule HaCaT sono state esposte all'irradiazione UVB e quindi incubate con SAL per studiare la vitalità cellulare, la lattato deidrogenasi (LSD) nei terreni di coltura, il livello di specie reattive dell'ossigeno (ROS) intracellulare, lo stress ossidativo, l'autofagia e gli effetti regolatori sulla proteina SIRT1.Risultati: il pretrattamento con SAL (25, 50 e 100 μM) ha aumentato la vitalità cellulare e ha inibito il rilascio di LDH nelle cellule HaCaT soggette a raggi UVB.SAL (100 μM) ha ridotto significativamente il livello di ROS intracellulare e ha soppresso lo stress ossidativo, con un aumento del contenuto di MDA e una maggiore attività SOD.Inoltre, il pretrattamento con SAL ha migliorato l'autofagia nelle cellule HaCaT irradiate con UVB, aumentata l'espressione proteica di Beclin-1 e ATG7 e diminuita l'espressione proteica di P62.Abbiamo anche scoperto che il pretrattamento con SAL ha aumentato la proteina SIRT1 nelle cellule HaCaT irradiate.SAL ha protetto il danno indotto da UVB in modo dipendente dall'autofagia e da SIRT1, poiché l'aumento della vitalità indotto da SAL è stato significativamente attenuato dall'inibitore specifico dell'autofagia Wortmannin (1 μM) o dall'inibitore SIRT1 EX-527 (100 nM).Discussione: i risultati del presente studio ipotizzano che il SAL sopprima il danno e l'autofagia indotti da UVB migliorando l'espressione di SIRT1.Parole chiave: cheratinociti, salidroside, radiazioni ultraviolette, stress ossidativo, autofagia, SIRT1La pelle è un organo protettivo autoregolato progettato per mantenere l'omeostasi quando esposto agli agenti ambientali.I cheratinociti sono una componente importante della struttura epidermica della pelle umana e svolgono un ruolo chiave nella costruzione e nella funzione dell'epidermide, proteggendo così il corpo dall'invasione esterna.La luce solare è la principale fonte di radiazioni ultraviolette (UV), tra cui gli UVB (320–280 nm) sono il tipo UV più distruttivo e possono raggiungere la superficie terrestre.1 UVB colpisce principalmente l'epidermide della pelle ed è considerato un importante fattore di rischio che porta alla formazione di radicali liberi, infiammazione acuta e aumento del rischio di cancro della pelle.2 Le radiazioni UVB a lungo termine possono causare danni da stress ossidativo, promuovere l'invecchiamento cellulare (fotoinvecchiamento),3 produrre segni di invecchiamento precoce della pelle, come macchie di pigmentazione , rughe profonde e aumento del rischio di cancro della pelle.4 Gli UVB inducono direttamente danni al DNA promuovendo la formazione del dimero di ciclobutano pirimidina.Quando il danno al DNA supera la capacità di rimozione della riparazione dell'escissione del nucleotide (NER), un gran numero di mutazioni viene prodotto nella pelle normale esposta alla luce solare, con conseguente morte cellulare, fotoinvecchiamento e cancro.5,6L'autofagia è un processo di degradazione lisosomiale evolutivamente conservato in cui gli organelli danneggiati vengono inghiottiti dagli autofagosomi e consegnati alla degradazione del lisosoma.L'autofagia è un processo biologico che mantiene l'omeostasi quando le cellule subiscono condizioni di stress come fame, danno ossidativo, risposta infiammatoria, risposta immunitaria, ecc., promuovendo così la sopravvivenza cellulare.L'attivazione dell'autofagia sotto vari stress può eliminare efficacemente gli aggregati intracellulari e gli organelli danneggiati, promuovendo così la sopravvivenza.7 Il danno al DNA e lo stress genotossico possono anche indurre l'autofagia, portando a effetti citoprotettivi.8 Nei cheratinociti irradiati con luce ultravioletta, la risposta dell'autofagia delle cellule è inibito.9 Al contrario, la promozione dell'autofagia cellulare può proteggere i cheratinociti dalla morte cellulare indotta dai raggi UV.10 Pertanto, nei cheratinociti cutanei indotti dai raggi UV, l'autofagia cellulare svolge un ruolo protettivo, inibisce il danno al DNA e la senescenza cellulare e quindi previene il cancro della pelle.11 ,12Il salidroside (SAL) è il componente attivo della Rhodiola rosea, che ha mostrato protezione contro la senescenza prematura nei fibroblasti dermici umani e inibisce la melanogenesi nella pelle di cavia indotta da UVB,13,14 e previene il cancro della pelle indotto da sostanze chimiche nei topi inibendo la risposta infiammatoria .15 Nei cheratinociti irradiati dai raggi UV, il SAL può inibire la risposta infiammatoria e lo stress ossidativo.16,17In questo studio, abbiamo studiato come il trattamento con SAL regola l'autofagia nei cheratinociti umani indotti da UVB.Nel frattempo, l'espressione dei geni correlati all'autofagia, come Beclin 1, ATG7, P62 e SIRT1, è stata analizzata quantitativamente.Inoltre, abbiamo studiato i ruoli dell'autofagia e SIRT1 nell'effetto protettivo del SAL nei cheratinociti irradiati da UVB.Le cellule HaCaT della linea cellulare di cheratinociti epidermici umani immortalate (Accademia delle scienze cinese, Shanghai, Cina) sono state coltivate in DMEM a basso contenuto di glucosio integrato con FBS al 10% (Gibco, NY, USA) a 37 ° C e 5% di CO2.Le cellule (70–80% confluenti) sono state pretrattate con SAL (0–200 μM, 43.866, Sigma-Aldrich, Germania) per 2 ore, quindi i terreni sono stati rimossi e aggiunti con soluzione salina tampone fosfato fresca (PBS).Queste cellule sono state quindi irradiate con UVB.Il mono strato di cellule HaCaT ha raggiunto il 70-80% di confluenza e è stato lavato con PBS.Quindi, le cellule sono state risciacquate con uno strato sottile di PBS e pretrattate con SAL per 2 ore ed esposte a UVB da una lampada fluorescente UV (JCB35-24-01, Sigma, Shanghai, Cina) (intervallo: 280–315 nm; picco intensità: 312 nm) a dosi rispettivamente di 10, 25 e 50 mJ/cm2.Durante l'irradiazione, la piastra di cellule di controllo è stata schermata e il mezzo è stato rimosso e quindi ricoperto con uno strato sottile di PBS.18 Quindi, le cellule sono state coltivate in terreno fresco contenente SAL per ulteriori 24 h.La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando un test MTT (M2128, Sigma-Aldrich, Germania).Le cellule HaCaT sono state seminate in piastre da 96 pozzetti a una densità di 5 × 104 cellule/pozzetto.Dopo la crescita notturna, le cellule sono state pretrattate con SAL per 2 ore ed esposte a UVB.In alcuni esperimenti, le cellule sono state anche co-incubate con Wortmannin (HY-10197, MedChemExpress) o EX-527 (HY-15452, MedChemExpress).Le cellule sono state lavate con PBS e incubate con soluzione MTT (0,5 mg/mL, 20 µL/pozzetto) per 4 ore a 37°C.Quindi, il supernatante è stato rimosso e DMSO (100 µL/pozzetto) è stato aggiunto a ciascun pozzetto per dissolvere i cristalli di formazano e l'assorbanza è stata misurata a 570 nm di densità ottica (OD) utilizzando un lettore di micropiastre (Bio-Rad Laboratories, Inc. ., Ercole, CA, USA).La vitalità cellulare è stata calcolata come percentuale di cellule vitali delle cellule trattate rispetto a quelle non trattate.19 L'esperimento è stato eseguito in triplicato e ripetuto almeno tre volte.Il danno cellulare è stato valutato misurando il rilascio di LDH nel fluido extracellulare utilizzando un kit commerciale (A020-3, Nanjing Jiancheng, Nanchino, Cina).Le cellule HaCaT sono state trattate con SAL e UVB per le ore indicate, quindi sono stati raccolti 0,2 mL di terreno di coltura e la DO di 490 nm è stata misurata per determinare la quantità di LDH mediante spettrofotometria (U/dL).18 L'esperimento è stato eseguito in triplicato e ripetuto almeno tre volte.I livelli intracellulari di ROS sono stati determinati con l'indicatore fluorescente DCFH-DA (Sigma-Aldrich).DCFH-DA si diffonde nelle cellule e si trasforma in DCFH, che reagisce con ROS per formare il DCF (fluorescente verde).Dopo che le cellule HaCaT sono state seminate sopra i vetrini coprioggetto in piastre da 24 pozzetti e trattate con SAL e UVB, sono state lavate con PBS e quindi incubate con DCFH-DA (10 μM) al buio per 30 minuti e la fluorescenza DCFH intracellulare è stato determinato utilizzando un microscopio a fluorescenza (IX71, Olympus, Giappone) (lunghezza d'onda di emissione: 520 nm; lunghezza d'onda di eccitazione: 488 nm).20 L'esperimento è stato eseguito in triplicato e ripetuto almeno tre volte.Il contenuto di MDA (A003-1, Nanjing Jiancheng) e l'attività SOD (A001-1, Nanjing Jiancheng) nelle cellule HaCaT sono stati misurati con un'assorbanza di 532 e 520 nm da un lettore di micropiastre e sono stati espressi come proteina nmol/mg e proteina U/mg, rispettivamente.L'esperimento è stato eseguito in triplicato e ripetuto almeno tre volte.Le cellule HaCaT sono state piastrate su vetrini coprioggetto e pretrattate con SAL ed esposte all'irradiazione UVB (25 mJ/cm2) per ulteriori 24 ore.Le colture sono state fissate con paraformaldeide al 4% (pH 7,4) per 20 minuti e bloccate con BSA all'1% e permeabilizzate con Triton-X-100 allo 0,1% per 10 minuti.Quindi, le cellule sono state incubate con l'anticorpo anti-LC3-II (AF4650, Affinity Biosciences, Cina) a 4°C durante la notte, seguito da un anticorpo secondario coniugato con FITC per 1 ora.Dopo il lavaggio con PBS, le cellule sono state trattate con DAPI (10 mg/mL) e le microfotografie sono state eseguite con un microscopio a fluorescenza (IX71).È stato contato il numero di cellule LC3-II-positive e DAPI-positive ed è stata calcolata la percentuale di cellule LC3-II-positive (normalizzate in cellule DAPI-positive).Almeno 100 cellule DAPI-positive sono state contate in ciascun gruppo.21 L'esperimento è stato eseguito in triplicato e ripetuto almeno tre volte.La proteina totale è stata estratta dalle cellule HaCaT utilizzando i reagenti di estrazione RIPA (Solarbio, Pechino, Cina).Il campione proteico (50 μg) è stato separato mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato (SDS-PAGE).Dopo il trasferimento su una membrana PVDF (Millipore, Bedford, MA), i campioni sono stati incubati con anticorpi primari specifici (diluiti 1:200): Beclin-1 (sc-48341, Santa Cruz Biotechnology, USA), ATG7 (sc-376212), P62 (sc-28359) e SIRT1 (sc-74504) a 4°C durante la notte.Dopo il lavaggio con PBS, la membrana è stata incubata con un anticorpo secondario marcato con HRP (1:500).La densità delle bande proteiche è stata visualizzata da ECL (Thermo, Waltham, MA, USA), analizzata utilizzando il software ImageJ e normalizzata in β-actina.Tutti i valori sono presentati come media ± deviazione standard (SD) da almeno tre esperimenti e analizzati dal software statistico SPSS 20.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).Per confrontare le differenze tra tre o più gruppi sono stati applicati i test ANOVA unidirezionale e Student–Newman–Keuls (SNK).P<0,05 è stato considerato come significatività statistica.I cheratinociti umani (cellule HaCaT) sono stati esposti all'irradiazione UVB (0, 10, 25, 50 mJ/cm2) per 24 ore.Il carattere citotossico degli UVB è stato esaminato mediante il test MTT.Come previsto, la vitalità cellulare è stata ridotta dall'irradiazione UVB in modo dipendente dalla concentrazione (P <0, 05) (Figura 1A).Abbiamo studiato gli effetti di SAL (0–200 μM) contro le diminuzioni della vitalità cellulare mediate da UVB.SAL non ha mostrato effetti tossici evidenti sulle cellule HaCaT da 0 a 100 μM e ha prodotto una lieve tossicità a 200 μM (P <0,05) (Figura 1B).Abbiamo preso 25, 50 e 100 μM di SAL per cellule HaCaT con UVB (25 mJ/cm2).La riduzione della vitalità cellulare indotta da UVB è stata significativamente attenuata dal pretrattamento delle cellule con SAL in modo dose-dipendente (Figura 1C).Abbiamo quindi rilevato il rilascio di LDH nel mezzo di coltura dalle cellule HaCaT.Il pretrattamento SAL ha ridotto significativamente il contenuto di LDH (P <0,05) (Figura 1D).Poiché il SAL ha dimostrato la massima vitalità cellulare e il minor rilascio di LDH a concentrazioni di 100 μM, abbiamo preso 100 μM di SAL per la dose ottimale di ulteriori studi.Figura 1 Effetto del SAL sulla vitalità cellulare delle cellule HaCaT con UVB.(A) UVB induce citotossicità nelle cellule HaCaT.(B) La vitalità cellulare delle cellule HaCaT non è stata influenzata da SAL.(C) SAL previene la citotossicità indotta da UVB.(D) SAL inibisce il rilascio di LDH dalle cellule HaCaT.ANOVA è stata eseguita per l'analisi.I dati sono mostrati come media ± SD di tre esperimenti indipendenti.*P<0,05, ***P<0,001 rispetto al gruppo di controllo;##P<0,01, ###P<0,001 vs gruppo UVB.Figura 1 Effetto del SAL sulla vitalità cellulare delle cellule HaCaT con UVB.(A) UVB induce citotossicità nelle cellule HaCaT.(B) La vitalità cellulare delle cellule HaCaT non è stata influenzata da SAL.(C) SAL previene la citotossicità indotta da UVB.(D) SAL inibisce il rilascio di LDH dalle cellule HaCaT.ANOVA è stata eseguita per l'analisi.I dati sono mostrati come media ± SD di tre esperimenti indipendenti.*P<0,05, ***P<0,001 rispetto al gruppo di controllo;##P<0,01, ###P<0,001 vs gruppo UVB.I livelli di ROS sono stati rilevati dalla colorazione DCFH-DA.Le immagini microscopiche hanno mostrato un'intensità di fluorescenza verde ampiamente aumentata nelle cellule HaCaT irradiate da UVB e il pretrattamento SAL ha attenuato la produzione di ROS intracellulare (Figura 2A).L'intensità DCFH-DA delle cellule HaCaT è stata significativamente aumentata da UVB, che è stata significativamente attenuata dal pretrattamento con SAL (P <0, 05) (Figura 2B).SAL ha anche invertito notevolmente lo stress ossidativo indotto dall'irradiazione UVB, con contenuto di MDA ridotto e maggiore attività SOD rispetto alle cellule con solo UVB (entrambi P <0, 05) (Figura 2C e D).Figura 2 Effetto del SAL sul danno ossidativo nelle cellule HaCaT.(A) La produzione di ROS intracellulare è stata rilevata dalla colorazione DCFH-DA, che mostra una fluorescenza verde (200 ×).(B) L'intensità della fluorescenza DCFH-DA è ridotta da SAL nelle cellule HaCaT indotte da UVB.Il contenuto di MDA (C) e l'attività SOD (D) sono stati misurati per valutare lo stress ossidativo.I dati sono mostrati come media ± SD di tre esperimenti indipendenti.***P<0,001 rispetto al gruppo di controllo;###P<0,001 vs gruppo UVB.Figura 2 Effetto del SAL sul danno ossidativo nelle cellule HaCaT.(A) La produzione di ROS intracellulare è stata rilevata dalla colorazione DCFH-DA, che mostra una fluorescenza verde (200 ×).(B) L'intensità della fluorescenza DCFH-DA è ridotta da SAL nelle cellule HaCaT indotte da UVB.Il contenuto di MDA (C) e l'attività SOD (D) sono stati misurati per valutare lo stress ossidativo.I dati sono mostrati come media ± SD di tre esperimenti indipendenti.***P<0,001 rispetto al gruppo di controllo;###P<0,001 vs gruppo UVB.Per valutare la regolazione del SAL sull'autofagia nei cheratinociti irradiati da UVB, le cellule HaCaT sono state colorate con l'anticorpo LC3-II.Gli autofagosomi sono stati visualizzati dalle immagini gialle, ottenute dalla fusione di punti verdi (LC3-II) con punti blu (DAPI).L'autofagia è stata soppressa dall'irradiazione UVB nelle cellule HaCaT.SAL ha migliorato l'autofagia e ha mostrato fluorescenza gialla nelle cellule HaCaT (Figura 3A).La percentuale di cellule LC3-II-positive era significativamente più alta nelle cellule trattate con SAL e UVB rispetto alle cellule con sole UVB (Figura 3B).Western blot è stato effettuato per determinare l'espressione proteica di Beclin-1, ATG7 e P62 (Figura 3C).SAL ha notevolmente migliorato le espressioni proteiche Beclin-1 e ATG7 (Figura 3D ed E).Inoltre, SAL ha ridotto l'espressione della proteina P62 (Figura 3F).Figura 3 Effetto del SAL sull'autofagia e sulle proteine ​​correlate nelle cellule HaCaT.(A) Le cellule HaCaT di controllo, UVB e/o SAL sono state colorate con l'anticorpo LC3-II (verde, × 200).(B) SAL aumenta significativamente il numero di cellule con punti LC3-II.(C) Macchie rappresentative delle proteine ​​​​correlate all'autofagia mediante analisi Western blot.SAL aumenta significativamente l'espressione proteica di Beclin-1 (D), ATG7 (E) e diminuisce l'espressione proteica di P62 (F).I dati sono mostrati come media ± SD di tre esperimenti indipendenti.*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 rispetto al gruppo di controllo;###P<0,001 vs gruppo UVB.Figura 3 Effetto del SAL sull'autofagia e sulle proteine ​​correlate nelle cellule HaCaT.(A) Le cellule HaCaT di controllo, UVB e/o SAL sono state colorate con l'anticorpo LC3-II (verde, × 200).(B) SAL aumenta significativamente il numero di cellule con punti LC3-II.(C) Macchie rappresentative delle proteine ​​​​correlate all'autofagia mediante analisi Western blot.SAL aumenta significativamente l'espressione proteica di Beclin-1 (D), ATG7 (E) e diminuisce l'espressione proteica di P62 (F).I dati sono mostrati come media ± SD di tre esperimenti indipendenti.*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 rispetto al gruppo di controllo;###P<0,001 vs gruppo UVB.L'espressione proteica di SIRT1 è stata determinata mediante Western blot.L'irradiazione UVB ha stimolato una diminuzione dell'espressione di SIRT1 nelle cellule HaCaT, ma il pretrattamento con SAL ha invertito la diminuzione della proteina SIRT1 (Figura 4A e B).Per studiare ulteriormente il ruolo funzionale dell'autofagia e della via SIRT1 nelle cellule HaCaT trattate con SAL, le cellule sono state pretrattate con l'inibitore dell'autofagia, Wortmannin (1 μM) o inibitore SIRT1 EX-527 (100 nM), e quindi incubate con SAL e UVB irradiazione.I risultati hanno dimostrato che l'effetto protettivo del SAL (aumento della vitalità cellulare) è stato notevolmente invertito dall'inibizione dell'autofagia o SIRT1 nelle cellule HaCaT irradiate con UVB (Figura 4C e D).Figura 4 SIRT1 e l'autofagia implicano gli effetti protettivi del SAL nelle cellule HaCaT irradiate con UVB.(A) Macchie rappresentative della proteina SIRT1.(B) Quantificazione del Western blot per la proteina SIRT1.Le cellule sono state pretrattate con l'inibitore dell'autofagia, Wortmannin (1 μM) (C) o l'inibitore SIRT1 EX-527 (100 nM) (D).I dati sono mostrati come media ± SD di tre esperimenti indipendenti.***P<0,001 rispetto al gruppo di controllo;##P<0,01, ###P<0,001 vs gruppo UVB;$P<0,001 vs gruppo UVB + SAL.$P<0,001 vs gruppo UVB + SAL.Figura 4 SIRT1 e l'autofagia implicano gli effetti protettivi del SAL nelle cellule HaCaT irradiate con UVB.(A) Macchie rappresentative della proteina SIRT1.(B) Quantificazione del Western blot per la proteina SIRT1.Le cellule sono state pretrattate con l'inibitore dell'autofagia, Wortmannin (1 μM) (C) o l'inibitore SIRT1 EX-527 (100 nM) (D).I dati sono mostrati come media ± SD di tre esperimenti indipendenti.***P<0,001 rispetto al gruppo di controllo;##P<0,01, ###P<0,001 vs gruppo UVB;$P<0,001 vs gruppo UVB + SAL.$P<0,001 vs gruppo UVB + SAL.Nel presente studio, abbiamo esplorato l'effetto protettivo del SAL sull'HaCaT esposto ai raggi UVB.L'irradiazione UVB ha ridotto la vitalità cellulare delle cellule HaCaT, che è stata attenuata dal pretrattamento con SAL.Nelle cellule HaCaT esposte all'irradiazione UVB, il SAL ha soppresso la produzione intracellulare di ROS e lo stress ossidativo, ha migliorato l'autofagia e ha modulato le espressioni proteiche correlate all'autofagia, tra cui Beclin-1, ATG7 e P62.SAL ha invertito la diminuzione dell'espressione proteica di SIRT1 mediante irradiazione UVB.L'inibitore dell'autofagia Wortmannin o l'inibitore SIRT1 EX-527 potrebbero abolire l'aumento della vitalità da parte del SAL.Nel loro insieme, SAL protegge le cellule HaCaT dal danno indotto dall'irradiazione UVB migliorando l'autofagia e l'espressione di SIRT1.Nei nostri risultati, l'irradiazione UVB ha ridotto la vitalità (Figura 1C) e ha aumentato la generazione di ROS (Figura 2) nelle cellule HaCaT.Ciò suggerisce che UVB induce danno ossidativo nelle cellule HaCaT e provoca la morte cellulare.Pertanto, il danno ossidativo derivato dai ROS potrebbe simulare il fotoinvecchiamento dei cheratinociti e il rischio di cancro della pelle.I ROS sono un importante mediatore per il fotoinvecchiamento dei cheratinociti.22 Numerosi antiossidanti possono proteggere i cheratinociti dai danni UV.23 Inoltre, il nostro studio precedente ha dimostrato che l'astragaloside IV ha un effetto inibitorio sullo stress ossidativo e sopprime l'apoptosi nelle cellule HaCaT con irradiazione UVB. 24 Questo studio ha aggiunto il SAL come un altro agente con effetto soppressivo sul danno ossidativo nelle cellule HaCaT.Questi effetti possono essere correlati alla diminuzione dell'apoptosi e all'aumento dell'espressione di Nrf2 da parte di SAL.17È stato dimostrato che lo stress ossidativo gioca un ruolo importante nella patogenesi di molte malattie, in cui i radicali liberi come le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono il fulcro e l'obiettivo della prevenzione e del trattamento delle malattie.Attualmente i prodotti naturali ad attività antiossidante sono ampiamente utilizzati per prevenire e curare diverse malattie sistemiche causate da stress ossidativo, come la Rhodiola rosea o il suo principio attivo SAL.Nel diabete, l'ossidazione del glucosio e l'ossidazione dei lipidi in condizioni di iperglicemia portano a un'eccessiva produzione di radicali liberi, squilibrio del sistema ossidativo e antiossidante, con conseguente stress ossidativo.Gli studi hanno dimostrato che il SAL mostra effetti antiossidanti in diversi modelli di diabete.Il SAL ha potenziato l'attività di SOD e ridotto il contenuto di MDA nei campioni di sangue di topi diabetici.25 Inoltre, il SAL ha migliorato l'iperglicemia e allevia lo stress ossidativo nei topi db/db indotto da una dieta ricca di grassi, accompagnato da un aumento della massa cellulare β e Replicazione delle β-cellule.26 Il SAL mostra un effetto antiossidante sui cardiomiociti, che può ridurre significativamente l'effetto inibitorio dell'H2O2 sulla crescita delle cellule H9c2 e ridurre i livelli cellulari di ROS e MDA e migliorare le attività di SOD e catalasi (CAT) .27 L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria vascolare cronica associata a stress ossidativo.In un modello in vitro di cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) indotte da lipoproteine ​​a bassa densità ossidate (ox-LDL), il trattamento con SAL ha protetto HUVEC dai danni inibendo lo stress ossidativo e migliorando la disfunzione mitocondriale,28 e protetto contro ox-LDL- danno endoteliale indotto e stress ossidativo potenziando l'autofagia mediata dalla via SIRT1-FoxO1.29 Nel complesso, il SAL può migliorare il diabete e le malattie cardiovascolari attraverso l'effetto antiossidante e i meccanismi specifici sono correlati alla riduzione della produzione di ROS, all'inibizione della morte cellulare e all'aumento autofagia.Questo studio ha confermato che il SAL può ridurre il danno cheratinocitario indotto dalle radiazioni ultraviolette inibendo lo stress ossidativo.Il meccanismo specifico del SAL che regola lo stress ossidativo non è ancora chiaro e deve essere ulteriormente studiato.Nel presente studio, SAL ha migliorato l'autofagia nelle cellule HaCaT irradiate da UVB (Figura 3A e B), che è stata convalidata dalla modulazione delle proteine ​​​​Beclin-1, ATG7 e P62 (Figura 3C e D).Beclin-1 è un regolatore chiave dell'autofagia e dell'endocitosi e comporta il mantenimento della barriera epidermica.30 L'espressione di ATG7 è stata ridotta nei cheratinociti irradiati con ultravioletti.9 L'espressione della proteina p62 è stata sottoregolata nell'autofagia e la proteina p62 è stata aumentata da un inibitore dell'autofagia 3-MA nelle cellule HaCaT.31 I nostri risultati mostrano che l'irradiazione UVB ha inibito l'autofagia delle cellule HaCaT e il SAL ha migliorato l'autofagia nelle cellule HaCaT irradiate con UVB.SAL può modulare l'autofagia in vari tipi cellulari.Nelle cellule di cancro gastrico umano, l'apoptosi indotta da SAL e l'autofagia potenziata e un inibitore dell'autofagia clorochina ha potenziato l'apoptosi indotta da SAL.32 Ciò indica che l'autofagia indotta da SAL è protettiva e questa ipotesi è supportata dal risultato che la vitalità cellulare è stata ridotta dall'autofagia specifica inibitore Wortmannin nelle cellule HaCaT con SAL (Figura 4C).Inoltre, l'effetto dell'autofagia protettiva da parte di SAL è validato anche in altri modelli cellulari.Ad esempio, il SAL ha potenziato l'autofagia e protetto dalla morte cellulare delle cellule neuronali ed endoteliali.33,34 L'autofagia è in grado di ritardare il processo di fotoinvecchiamento cutaneo causato dai raggi ultravioletti, quindi agisce come processo inibitorio contro il cancro della pelle.35 Prevenzione mediata dall'attivazione dell'autofagia dei cheratinociti umani dallo stress ossidativo e dalla morte cellulare da parte di un antiossidante.36 Al contrario, i cheratinociti con deficit di autofagia hanno mostrato un aumento del danno al DNA e della senescenza nella condizione di stress ossidativo.11In questo studio, SAL ha aumentato l'espressione della proteina SIRT1 (Figura 4A e B), che è stata associata all'aumento della vitalità cellulare di SAL (Figura 4C e D).SIRT1 è una proteina deacetilasi e regola varie vie del metabolismo, dell'invecchiamento e del cancro.SIRT1 è espresso nei cheratinociti, ma il suo livello di espressione è stato ridotto dalle radiazioni UV e dall'esposizione al perossido di idrogeno in modo ROS-dipendente.37 L'espressione o l'attivazione di SIRT1 potrebbe aumentare il flusso autofagico e proteggere i cheratinociti umani dai danni indotti dal perossido di idrogeno.38 Ciò suggerisce che SAL migliora l'espressione di SIRT1 attraverso l'inibizione dei ROS intracellulari e potrebbe esserci un asse ROS-SIRT1-autofagia nei cheratinociti.L'autofagia potenziata dal SAL attraverso la sovraregolazione dell'espressione di SIRT1 e l'inibizione dello stress ossidativo nella lesione endoteliale indotta da ox-LDL.29 L'autofagia dipendente dall'attivazione di SIRT1 è stata osservata nei fibroblasti dermici umani indotti dall'irradiazione UVB.39 Se il SAL modula anche questo ROS-SIRT1 -l'asse dell'autofagia nei cheratinociti non è chiaro.SAL mostra effetti fotoprotettivi nei cheratinociti trattati con UVB.Inoltre, l'autofagia regolata da SAL potrebbe comportare gli effetti UVB su SIRT1.Tuttavia, non abbiamo potuto chiarire se SAL regola altre vie di segnalazione nei cheratinociti in coltura e sfidati con UVB.SIRT3 è una proteina omologa di SIRT1 e l'aumento della proteina di SIRT3 era associato all'induzione dell'autofagia e alla riduzione della senescenza e del danno tissutale nella pelle del topo irradiata dai raggi UV.40 Il SAL può anche aumentare l'espressione proteica di SIRT3 e attenuare la senescenza cellulare endoteliale e la cardiomiopatia diabetica .41,42 Nrf2 è un fattore di trascrizione antiossidante e la sua attivazione e traslocazione nucleare hanno portato all'espressione di proteine ​​antiossidanti nelle cellule HaCaT ed è associato a una ridotta produzione di ROS.43 Nrf2 è anche collegato alla regolazione dell'autofagia nei cheratinociti regolando Nrf2-p62 pathway.44 Il trattamento con SAL ha sovraregolato la traslocazione nucleare di Nrf2 e l'attività di trascrizione e ha ridotto la produzione di ROS nelle cellule HaCaT.17 Tuttavia, non è chiaro se l'attivazione di Nrf2 sia associata all'autofagia di HaCaT.La via p38 MAPK regola anche l'autofagia nelle cellule HaCaT e nei topi fotoinvecchiamento indotti da UVB.45 Il SAL può anche sottoregolare l'espressione della proteina p38 e inibire lo stress ossidativo nelle cellule tumorali del polmone,46 non è noto se SAL regoli la p38 nei cheratinociti.Resta da chiarire il meccanismo che media le nuove vie del segnale da parte del SAL nei cheratinociti con danno UVB.In conclusione, riportiamo che il SAL mostra nuovi effetti fotoprotettivi nei cheratinociti trattati con UVB, come l'inibizione dell'apoptosi, il miglioramento del ripristino dell'autofagia, la riduzione dello stress ossidativo e la sovraregolazione della proteina SIRT1.Questi risultati suggeriscono la potenziale applicazione del SAL come agente contro il fotodanneggiamento della pelle.Tuttavia, si trattava di uno studio in vitro e i suoi effetti sul fotodanneggiamento devono essere confermati in ulteriori indagini in vivo.Questi risultati suggeriscono che il SAL potrebbe indurre l'autofagia protettiva, che potrebbe agire come potenziale agente fotoprotettivo per prevenire il cancro della pelle.I dati a supporto dei risultati sono disponibili presso l'autore corrispondente su ragionevole richiesta.Tutti gli autori hanno accettato di pubblicare questo manoscritto.JK ha eseguito esperimenti e ha scritto il manoscritto;JW ha eseguito esperimenti e raccolto dati;XW ha analizzato i dati ed eseguito l'analisi statistica;YHY ha progettato e supervisionato lo studio e ha rivisto il manoscritto.Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto.Tutti gli autori hanno dato un contributo significativo al lavoro riportato, sia nella concezione, nella progettazione dello studio, nell'esecuzione, nell'acquisizione dei dati, nell'analisi e nell'interpretazione, sia in tutte queste aree;ha partecipato alla stesura, revisione o revisione critica dell'articolo;ha dato l'approvazione definitiva alla versione da pubblicare;hanno concordato la rivista a cui è stato presentato l'articolo;e accetta di essere responsabile di tutti gli aspetti del lavoro.Questo studio è stato sostenuto dal Research Initiation Fund for Introducing Talents of Shanghai Pudong Hospital (Grant No: YJRCJJ201802).Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse in questo lavoro.1. 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